氧化应激与卵巢老化

关键词：活性氧；抗氧化剂；氧化应激；卵巢老化

Keywords：reactiveoxygenspecies;antioxidant;oxidativestress;ovaryaging

老化是复杂的生物现象,在机体老化过程中,营养状态不足、慢性炎症和氧化应激(oxidativestress)参与了许多与年龄相关的疾病的发生。近年研究发现,在人体器官老化的各个方面都涉及到氧化应激。本文希望从人体器官老化的相关机制出发,分析卵巢老化的机制,探讨是否能够通过饮食调整控制卵巢老化的速度。

1氧化应激的概念

已知人类每天的活动都会产生自由基,自由基活性高,是非常不稳定的分子,它们通过从核酸、脂类、蛋白质、碳水化合物获取电荷以达到稳定状态,这个过程引发的一系列连锁反应会导致细胞损伤和疾病。人体内有两种主要的自由基:活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮。活性氧主要包括超氧化物、过氧化氢(H2O2)和羟基3种。线粒体是ROS的主要来源。ROS作为信号传导分子,参与细胞的生理和病理过程。生理水平的ROS可以促进细胞的存活、增生和分化,但当细胞内ROS与抗氧化剂失衡时(ROS产生过多或抗氧化物不足),过多的ROS会与脂类、蛋白和核酸发生作用,导致膜整合性丢失、蛋白结构或功能发生变化及核酸损伤,引起细胞凋亡和坏死,也就发生了通常所说的氧化应激。

2氧化应激与女性年龄

在年轻动物或成人,细胞可以凭借复杂有效的系统维持自由基与抗氧化剂的平衡,但在年老后,这种平衡难以维继,从而损害了细胞内环境的稳定。在卵巢内也存在着同样的情况。第一,随年龄增加,卵巢内自由基产生增加。检测例接受IVF治疗的女性卵泡液中的氧化应激指数,发现其与患者年龄和促性腺激素用量呈负相关。第二,随年龄增加,卵巢内抗氧化物含量减少,清除自由基的能力下降。对小鼠的研究显示,随年龄增加,卵巢内多种抗氧化酶mRNA水平显著下降,卵巢间质细胞以及卵泡细胞脂类和蛋白氧化增加,DNA损伤也显著增加。绝经后女性卵巢内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性显著低于绝经前女性。高龄不孕妇女褪黑素显著下降。从接受IVF治疗的20例年轻女性(27～32岁)和20例高龄女性(38～41岁)的卵泡中获取颗粒细胞,发现≥38岁女性的颗粒细胞内编码SOD和过氧化氢酶的mRNA水平显著下降,二者在蛋白水平也明显下降,超微结构检查显示,这组患者的大部分颗粒细胞线粒体缺陷,脂滴减少。同样,获取接受IVF治疗的12例年轻女性(27～32岁)和12例高龄女性(39～45岁)的卵泡液,后者卵泡液中过氧化氢酶的活性较前者下降60%。第三,随年龄增加,卵巢内某些ROS也会减少,但ROS减少的速度与抗氧化剂减少的速度不一致。有研究发现,45岁以后,脂质过氧化作用在人类卵巢内缓慢减少,但SOD的活性在45岁以后迅速下降,GSH-Px的活性在50岁以后迅速下降,使卵巢内ROS与抗氧化物比例失衡。但也有少数研究发现卵泡液中ROS水平与年龄不相关。

另外,除了衰老过程中出现组织细胞内ROS与抗氧化物失衡外,一些与抗氧化物相关的基因变异也会影响体内抗氧化物的水平,导致氧化应激。例如,编码维生素C转运蛋白的基因的多态性与血浆维生素C水平密切相关,此外,谷胱甘肽S-转移酶基因多态性也影响人体维生素C的含量。编码抗氧化物的等位基因的多态性与中枢神经系统SOD、过氧化氢酶、GSH-Px和谷胱甘肽转移酶活性异常有关。但具有抗氧化物基因多态性的妇女是否存在卵巢功能衰退的风险,以及卵巢功能减退的年轻女性,是否存在影响抗氧化物转运、吸收的蛋白的基因变异、有无编码抗氧化物的等位基因的多态性,从而使细胞内ROS与抗氧化物失衡,导致氧化应激,引起卵巢功能减退,目前还没有相关研究。

3氧化应激与女性生殖

Agarwal等对氧化应激和抗氧化物对生育的影响进行了综述,认为氧化应激与卵母细胞受精和胚胎着床都有关系,而且还可能参与了不明原因不孕、多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等与生育相关的疾病的病理生理过程。

3.1氧化应激与卵巢内分泌功能

研究证实卵巢内ROS与抗氧化物的平衡对卵巢的内分泌功能有重要作用。切除大鼠的松果体,使其失去体内褪黑素(一种强有力的抗氧化物)的来源,应用DNA芯片和免疫组化方法对大鼠的卵巢进行检测,发现这组大鼠卵泡膜细胞和间质细胞17α-羟化酶(CYP17A1)明显高于对照组,ROS与抗氧化物的失衡影响卵巢甾体激素合成酶基因的表达。Oka?tani等观察到绝经前女性卵巢内芳香化酶活性急剧下降,芳香化酶的这种变化与年龄呈显著负相关,与卵巢内SOD和GSH-Px水平呈正相关。在卵巢匀浆中加入不同浓度的H2O2,可导致卵巢芳香化酶活性呈剂量依赖性下降,但如果在加入H2O2前先加入GSH-Px,则使芳香化酶活性呈剂量依赖性恢复。体外研究显示,在高龄女性的卵巢颗粒细胞中加入卵泡刺激素(FSH)进行培养,颗粒细胞雌二醇(E2)的产生与GSH-Px和还原型谷胱甘肽水平呈正相关,与脂质过氧化作用(LPO)呈负相关。

3.2氧化应激与卵子及胚胎质量

ROS水平异常升高对卵子的发育和质量有不良影响。从小鼠排卵前卵泡获取的卵母细胞与H2O2培养12h,成熟卵母细胞百分比显著减少,而给予褪黑素可以阻断H2O2对卵母细胞成熟的抑制作用。研究不同浓度的超氧阴离子、H2O2和次氯酸对小鼠刚排出的或稍老的卵母细胞(排出一段时间的卵母细胞)的影响,发现三者均可促进卵母细胞的老化,与对照组相比,暴露组卵母细胞透明带溶解时间延长,胞质微管动力学异常,主要皮质颗粒丢失,而稍老的卵母细胞对超氧阴离子等的处理尤其敏感。8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)是脱氧鸟苷的氧化衍生物,常被用做氧化作用的指标。对人类的研究显示,体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中卵母细胞退化率高的女性卵泡液内8-OHdG的浓度显著高于卵母细胞退化率低的女性。测定产生不同质量卵母细胞的卵泡液中的ROS水平和脂质过氧化作用,产生优质胚胎的卵母细胞卵泡液中的ROS水平和脂质过氧化作用与产生劣质胚胎的卵母细胞卵泡液中的ROS水平和脂质过氧化作用有显著不同。对接受IVF-ET治疗的女性进行分组组A包括7例患者对每例患者一个产生高质量胚胎和一个产生低质量胚胎的两个卵泡进行分析;组B包括13例患者,对每例患者一个有卵和一个未获卵的2个卵泡进行分析。结果发现,与产生低质量胚胎的卵母细胞的卵泡相比,高质量的胚胎来源于含有低水平H2O2的卵泡中的卵母细胞(P0.02),但有卵的卵泡其H2O2水平显著低于无卵的卵泡的H2O2水平(P0.)。作者认为在卵巢老化的过程中,卵泡液中H2O2逐渐升高,当卵泡老化成为空卵泡时,H2O2水平显著下降。卵冠丘细胞产生抗氧化剂,保护卵母细胞免于氧化损伤。研究发现,使IVF成功妊娠的卵母细胞,其卵冠丘细胞的SOD活性显著高于IVF失败者,因此,有学者认为可以将SOD活性作为辅助生殖技术成功的潜在生物学标志物。根据上述可以看到,ROS与抗氧化剂之间的平衡影响卵母细胞质量,这与ROS可能损伤卵母细胞有关。卵母细胞内谷胱甘肽不足会影响纺锤体的形成。对仓鼠的研究显示,暴露于二酰胺(针对谷胱甘肽的氧化剂)的仓鼠卵纺锤体形态紊乱,伴随染色体凝集。

3.3氧化应激与卵巢储备

研究证实卵巢内ROS与抗氧化剂的失衡可导致窦卵泡凋亡。抗氧化剂Sod1对正常窦卵泡的发育是必要的,敲除Sod1基因的小鼠窦卵泡减少;此外,作为非酶类的抗氧化剂维生素C的缺乏可以导致豚鼠卵泡广泛闭锁。已存在有力的证据证实,FSH的部分抗窦卵泡凋亡的作用是由FSH上调的抗氧化剂防御系统介导的,当促性腺激素(Gn)撤退、暴露于外源性毒物或电离辐射时,ROS是启动窦卵泡和窦卵泡颗粒细胞凋亡的关键信号。ROS对原始卵泡和初级卵泡死亡的作用尚不明确。对大鼠的研究显示,夜间补充褪黑素可以延迟生殖衰老,但对原始卵泡数没有影响。然而有研究证实,放疗前给予褪黑素预处理,可以对抗放疗对原始卵泡的损伤，表明ROS对这些小卵泡也可能有作用。

综上所述,氧化应激影响卵巢的内分泌功能,参与窦卵泡的凋亡,影响卵母细胞的质量。已知卵母细胞的胞浆是早期胚胎胞浆的主要成分,胚胎发育的第一步主要由存在于卵母细胞中的母源信息控制,因此,卵子的质量是决定早期胚胎发育和质量的关键因素。卵母细胞发生氧化应激,会导致受精和胚胎发育异常。

4氧化应激的测定与处理

4.1氧化应激的测定

由于每个个体所处环境、精神压力等不同,自由基的产生量不同;另外,影响食物中抗氧化剂含量的因素很多。因此,在临床研究中判定患者抗氧化物的摄入量并不容易。可以通过测定血浆、组织或细胞内抗氧化物的含量,来判断抗氧化物的摄入情况,从而得出可信的实验结果。体内抗氧化状态通常可以测定细胞内总抗氧化能力。丙二醛是脂质过氧化作用中产生的一种剧毒物,可以作为氧化应激的生物标志物。对于卵泡内活性氧的适宜浓度,Jana等选择因输卵管因素、子宫内膜异位症和多囊卵巢综合征接受IVF-ET的患者,测定卵泡液中的ROS值,结果发现,卵泡液(每μL)中ROS的上限值为光量子/s(cps),低于此值,受精率、Ⅰ和Ⅱ级胚胎形成率明显升高,胚胎DNA碎片显著减少。

4.2氧化应激的处理

目前已发现,补充抗氧化剂可以改善细胞内ROS与抗氧化物的平衡。细胞培养和动物研究显示,维生素E作为抗氧化剂,对阻止细胞膜脂质过氧化具有关键作用,其还可在胞浆和细胞核水平影响多种与炎症和免疫相关的基因。补充抗氧化剂对卵巢功能的影响也有一些相关研究。选择年轻、中年(进入月经周期前)和老年大鼠,给予褪黑素2个月。与对照组相比，褪黑素组G0～G1期细胞百分比显著下降;褪黑素使中年大鼠卵巢体积明显高于对照组,圆形卵母细胞明显增多,雌二醇水平得到改善。给1～1.5个月龄的小鼠喂食N-乙酰-L-半胱氨酸1年,与对照组相比,服药组小鼠产仔数明显增加,卵母细胞质量得到改善,NAD依赖性乙酰基转移酶mRNA(抗老化基因)表达增加,卵巢端粒酶活性增加,端粒长度增加。给大鼠服用染料木黄酮和白藜芦醇4个月(从12个月至15个月),与对照组比较,实验组卵泡闭锁显著减少,健康卵泡数显著增加,作者推测这种作用可能不仅是干预了原始卵泡向初级卵泡的转变,也可能由于抑制了卵泡的闭锁。小鼠从断奶或32周开始补充维生素C和E10周、20周或30周,结果显示无论早期还是晚期开始补充维生素C和E,都可以对抗老龄对卵母细胞数、获卵数和卵母细胞质量的不良影响。抗氧化剂对卵巢功能的改善可能与其影响卵细胞凋亡有关。已知卵泡液中的褪黑素降低重要细胞的凋亡。有研究发现,老龄雌性大鼠服用维生素E后血清丙二醛浓度明显下降卵泡颗粒细胞Bcl-2增加Bax下降。在人类一项完全随机、双盲、安慰剂对照的研究中,年龄在42～62岁的围绝经期和绝经期健康女性,褪黑素水平低下组补充褪黑素,可以使FSH水平下降。将前次IVF周期受精率低下、未妊娠的例患者分为2组,一组(56例）接受褪黑素(3mg/d)治疗,一组(59例)不用褪黑素,结果显示服用褪黑素组受精率[(50.0±38.0)%］较前次IVF-ET周期[(20.2±19.0)%显著改善,而未服药组受精率[(22.8±19.0)%与前次IVF-ET周期[(20.9±16.5)%]相似。进一步研究发现,给予褪黑素和(或)维生素E,可以使卵泡液内8-OHdG浓度显著下降。说明纠正了卵泡内ROS与抗氧化物的失衡之后,卵母细胞质量得以改善,从而改善了受精率。综上,补充抗氧化剂可能有利于延迟卵巢老化,但需要大样本的前瞻性临床研究进行进一步证实。另外,补充抗氧化剂的适宜剂量并不清楚,有动物实验显示补充药物剂量的抗氧化剂对生育结局产生了不良影响。

综上所述,卵巢内ROS与抗氧化剂的平衡对卵巢内分泌功能、卵母细胞质量和卵泡数有显著影响,二者的失衡参与卵巢的老化过程。补充抗氧化剂可能对延迟卵巢老化、改善卵母细胞质量有一定帮助,但对于补充哪些抗氧化剂、补充的剂量、使用时间及副反应,目前都不是非常明确,需要大样本、前瞻性临床研究来进一步探讨。对于卵巢功能减退的年轻女性,是否存在合成抗氧化物的基因的异常,以及抗氧化物基因多态性是否可以导致卵巢功能减退,相关的动物实验和临床研究数据还极为匮乏。随着越来越多的女性由于各种原因推迟生育，以及在中国单独二胎政策的实行,高龄不孕女性日益增多,卵巢功能的减退使这些患者助孕的成功率下降,因此,研究氧化应激对卵巢老化的影响有着重要的意义。

参考文献(略)

本文作者单位：医院生殖医学中心

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